摘要： 目的 同时用液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）和酶联免疫法（ELISA）检测患者体内25（OH）D3水平，分析两者结果的差异。方法 随机选取50例住院患者，对同一血清样本分别用LC-MS/MS法和ELISA法测定25（OH）D3水平，同时用LC-MS/MS法测定25（OH）D2的水平。结果 LC-MS/MS法测定的维生素D3的均数为14.99±6.51ng/mL，酶联免疫法测定的均数为20.91±9.70ng/mL，两者的相关系数为0.725（P＜0.01），线性相关方程为维生素D3（LC-MS/MS法）=4.829+0.486×维生素D3(ELISA法)。LC-MS/MS法组25（OH）D3浓度高于20ng/mL的比例17%，酶联免疫法组为52%，LC-MS/MS法组的25（OH）D2和25（OH）D3总浓度高于20ng/mL的为24%。25（OH）D2占25（OH）D总量的8.4%。 结论 LC-MS/MS法测定的维生素D3的数值明显低于ELISA法，两者正相关性较高，可经方程互换。酶联免疫法低估了体内维生素D的缺乏，检测25（OH）D3的同时需测定25（OH）D2浓度。
关键词：液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）；酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）；25（OH）D3 ；25（OH）D2

The body 25 (OH) D3 concentration measured by Liquid chromatography – tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） MAO Xudong, WU Yan,LIU Zhiweng,SHENG Hongguang,YU Shen,WANG Ying,LI Shuijun,WANG Hongfu, Department of Endocrine，Xuhui District Center Hospital, Shanghai 200031, China
Corresponding author：MAO Xudong, Email：maoxud@sina.com
ABSTRACT: Objective By liquid chromatography – tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) detected in patients with 25 (OH) D3 level in the body, to analyze the differences between the results.
Methods RandomLy selected 50 cases of hospitalized patients, the same serum samples were used LC-MS/MS method and ELISA methods for the determination of 25 (OH) D3 level. While using the LC-MS/MS method for determination of the level of 25 (OH) D2.
Results LC-MS/MS method for the determination of vitamin D3 with a mean of 14.99 ± 6.51ng/mL, measured by ELISA mean of 20.91 ± 9.70ng/mL, the correlation coefficient was 0.725 (P <0.01).The linear correlation equation was vitamin D3 (LC-MS/MS ) = 4.829 +0.486 × vitamin D3 (ELISA). 25 (OH) D3 concentration ratio of LC-MS/MS group is 17% higher than 20ng/m, ELISA group 52%.The total concentration of 25 (OH) D2 and 25 (OH) D3 useing LC-MS/MS method higher than 20ng/mL was 24%, 25 (OH) D2 accounted for 8.4% 25 (OH) D of the total.
Conclusion LC-MS/MS method for the determination of vitamin D was significantly lower than the ELISA method, positive correlation between LC-MS/MS and ELISA obviously. ELISA underestimated the lack of vitamin D. Measured 25 (OH) D2 concentration required in the detection of 25 (OH) D3.
Key Words：Liquid chromatography – tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）; 25（OH）D3 ；25（OH）D2

维生素D是一个脂溶性维生素，维持人体内钙的平衡，与骨质疏松密切有关，维生素D及活性维生素D在骨质疏松的治疗中广泛使用。同时由于维生素D受体在人体的广泛分布，维生素D的骨骼外效应越来越受到重视，维生素D与受体结合后能增强免疫功能，减少炎症反应，以及降低细胞增殖、分化和程序性死亡的癌症风险等等，补充维生素D可以减少糖尿病、高血压的发生，有助于预防前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤的发生。因此体内维生素D水平的准确检测愈发显得重要。

1 材料和方法
1.1 研究对象
随机选取2011年1月~2012年6月期间在我院住院就诊的患者50例，年龄（72.76±11.95）岁，并排除恶性肿瘤、甲亢﹑甲减、甲状旁腺亢进、甲状旁腺减退、肝硬化、激素服用者。
1.2 方法
抽取患者空腹血清，同时用酶联免疫法（ELISA）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）测定25（OH）D3，并用LC-MS/MS 法测定25（OH）D2。 25-羟基维生素D检测试剂盒（酶联免疫法）为英国 Immunodiagnostic Systems Linited (IDS Ltd)，货号AC-57F1，灵敏度5nmol/L，精密度批内分析 CV5.3%~6.7% ，批间分析 CV4.6%~8.7%。高效液相色谱-串联质谱检测技术（LC-MS/MS）以25羟基维生素D3-氘6和25羟基维生素D2-氘3为内标，分析数据由Analyst1.5软件采集，然后作定量分析处理。采用API 4000串联质谱仪（Applied Biosystems Inc.，USA），Analyst 1. 5分析软件；Shimadzu系列液相色谱仪（日本岛津公司）。低、中、高浓度质控的准确度应在85%~115%范围，精密度CV应在15%以内。
1.3 统计学处理
所有数据以均数±标准差表示，组间数据比较用t检验，并进行pearson相关分析。统计学处理使用SPSS13.0完成。
2 结果
2.1 液相色谱-质谱联用法和酶联免疫法的结果比较
LC-MS/MS测定的维生素D3的均值为14.99±6.51ng/mL，明显低于酶联免疫法测定的数值20.91±9.70ng/mL，两者正相关性较高，相关系数为0.725（P＜0.01），线性相关方程：维生素D3（LC-MS/MS）=4.829+0.486×维生素D3 (ELISA)。以25（OH）D3浓度20ng/mL为界限，高于20ng/mL的LC-MS/MS组为17%，高于20ng/mL的酶联免疫法组为52%，LC-MS/MS组的25（OH）D2和25（OH）D3总浓度高于20ng/mL的为24%。
表1 液相色谱-质谱联用法和酶联免疫法的结果比较（ ±S）
Comparision of the results of LC-MS/MS and ELISA
组别
例数
年龄
(岁)
25（OH）D3(ng/mL)
25（OH）D2(ng/mL)
LC-MS/MS组
50
72.76±11.95
14.99±6.51
0.96±3.43
ELISA组
50
72.76±11.95
20.91±9.70*

注：两组相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

2.2 LC-MS/MS法对体内25（OH）D2、25（OH）D3的检测
25（OH）D2的均数为0.96±3.43ng/mL，25（OH）D2+25（OH）D3总数的均数为16.64±7.19ng/mL，25（OH）D2占25（OH）D总量的8.4%。

3 讨论
维生素D是一类脂溶性的固醇类衍生物，主要有麦角钙化醇（维生素D2）和胆钙化醇（维生素D3）两种，两者的结构很相似，生理学功能也基本相同。人体获得维生素D的途径有两种，一是从食物中摄取，其中动物性食物中主要是维生素D3，而植物性食物中则主要是维生素D2；二是由皮肤组织内的7-脱氢胆固醇经日光中的紫外线照射后发生光化学反应转化生成维生素D3。除了深海鱼、鱼肝油、动物肝脏、蛋黄、牛奶和菌类以外，天然食物中维生素D含量较少，人体所需要的维生素D多数是通过皮肤合成的[1]。来源于膳食或皮肤组织的维生素D本身并不具有生物活性，必须经过两次连续的羟化过程才能转化成为具有生物活性的有效物质。从膳食和皮肤两条途径获取的维生素D与血浆维生素D结合蛋白（vitamin D binding protein, DBP）结合后被转运至肝脏，在肝脏内经25-羟化酶的作用首先转化成25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D），后者进入肾脏后再经过1a-羟化酶的催化生成具有生物活性的1,25-二羟基维生素D（25（OH）D2和25（OH）D3 1,25-dihydroxyvitamin D），并在DBP的载运下，经过血液到达靶器官并与细胞上的维生素D受体（vitamin D receptor, VDR）结合而发挥相应的生物学功能。血液中维生素D的半衰期仅为5~7d[2]，只能反映近期从食物中摄取和从皮肤内合成的维生素D的量。而25-羟基维生素D的半衰期却长达20~30d，是维生素D在血液循环中的主要存在形式，也是临床上衡量维生素D营养状况的主要血液生化指标。
根据国际标准,70 岁以上老人每日应摄入维生素D量为600 IU。随着体内维生素D检测技术水平的提高和检测范围的扩大，近几年对维生素D的缺乏有了新的认识，据最新估计全球可能有超过10亿人缺乏维生素D[3]，在妇女健康启动计划（WHI）项目中观察到美国超过57.1%的绝经后妇女维生素D缺乏，其中13%维生素D严重缺乏[4]，之类对这部分人群进行的3年随访发现维生素D浓度及饮食摄入量与抑郁症状发生呈负性关联[5]。在我国，维生素D的缺乏状态也同样严重，无论北方和南方均存在大规模的维生素D不足，调查显示北京成年女性运动者平均血清25-羟基维生素D 14.4ng/mL,不运动者12ng/mL[6]，在冬季的上海市区绝经后妇女平均血清25-羟基维生素D为17.1ng/mL,存在较严重的维生素不足占30%，维生素缺乏者占调查人口的68%[7]。
目前电化学发光免疫测定法（ECLIA）、称高效液相层析（high performance liquid chromatography，HPLC）、酶联免疫法（ELISA）、放射免疫分析法（RIA）是测定25-羟基维生素D3的较常用的方法，国内文献报道以RIA和ELISA居多，不同的测定方法得到的数据有一定差距，会影响到对人群维生素D3缺乏的判断。据2010年Johannes分别用Roche ECLIA法、DiaSoria RIA法和LC-MS/MS法3种方法对120例患者血清的25（OH）D3测定，DiaSoria RIA=0.975 (95%Confidence Interval{CI}:0.919–1.031 )×LC-MS/MS+3.02(95%CI:-0.42-6.46) ;Sy/x=8.01;r2=0.90；Roche ECLIA=0.948x（95%CI:0.830-1.067）×LC-MS/MS+13.01 (95%CI: 5.76-20.26); Sy/x=16.90; r2=0.58。LC-MS/MS 与RIA的结果十分接近，与ECLIA的结果相差较大[8]。而LC-MS/MS与ELISA对25-羟基维生素D3的测定比较未见报道，酶免疫分析法主要的缺陷是抗体之间的交叉反应导致的方法特异性不足，而色谱分析法可对这些分析物进行有效分离，从而获得足够的特异性，LC-MS/MS法的高选择性、特异性和敏感性有很大的优势，同时LC-MS/MS能对体内25（OH）D2的浓度进行检测，25（OH）D2占体内维生素D总量的10%左右，其最终转化成1,25（OH）D3发挥作用，故25（OH）D2的含量也不应忽视。本次研究通过对同一血清标本的检测，LC-MS/MS测定的25（OH）D3浓度明显低于酶联免疫法，国外目前倾向于用LC-MS/MS法更精确地反映体内维生素D的含量。
LC-MS/MS能准确地测定体内25（OH）D的含量，可分别测定25（OH）D3和25（OH）D2 。我国人群中的维生素D缺乏率可能有所低估，补充维生素D有广阔的前景。

[参考文献]
[1] Holick, MF. Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases. Am J Clin Nutr, 2004, 80(6 Suppl): 1678S-1688S.
[2] Zeitz U, et al. Impaired insulin secretory capacity in mice lacking a functional vitamin D receptor. FASEB J, 2003, 17(3): 509-511.
[3] Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med, 2007,357(3): 266-281.
[4] Millen AE, et al. Predictors of serum 25-hydroxyvitamin D concentrations among postmenopausal women: the Women’s Health Initiative Calcium plus Vitamin D clinical tELISAl. Am J Clin Nutr, 2010,91(5): ,1324-1335.
[5] Elizabeth BJ, et al. Vitamin D intake from foods and supplements and depressive symptoms in a diverse population of older women. Am J Clin Nutr, 2011,94:1104-1112.
[6] Foo LH, et al. Relationship between vitamin D status, body composition and physical exercise of adolescent girls in Beijing. Osteoporos Int, 2009, 20(3): 417-425.
[7] ZHANG Hao , HUANG Qirenet , et al. Vitamin D status of Shanghai postmenopausal women in winter. CHINESE JOURNAL OF OSTEOPOROSIS. 2011, 2011, 17(1):43-46
[8] Johannes MW, et al. Measurement of 25-OH-vitamin D in human serum using liquid chromatography tandem-mass spectrometry with comparison to radioimmunoassay andautomated immunoassay. Journal of Chromatography B, 2010,878:1163-1168.